最近涉及流式熒光的公司越發(fā)多了起來(lái)，相比于化學(xué)發(fā)光，它確實(shí)有自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其中最主要的特點(diǎn)就是可以實(shí)現(xiàn)1人份試劑的多項(xiàng)目聯(lián)合檢測(cè)。比如對(duì)于自身免疫的項(xiàng)目，化學(xué)發(fā)光一般都是單孔單檢，流式熒光可以做到單孔多聯(lián)檢，也就是相同用量的血清，化學(xué)發(fā)光只檢測(cè)了一個(gè)項(xiàng)目，流式熒光卻檢出了幾個(gè)甚至幾十個(gè)的項(xiàng)目。
首先介紹一下最關(guān)鍵的磁珠。不同類型的磁珠混在一起，儀器是怎么區(qū)分開的呢？目前有以下幾種類型：
1.靠磁珠的大小加以區(qū)分。
流式涉及兩個(gè)概念，F(xiàn)SC（前向散射光）和SSC（側(cè)向散射光）。從使用經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，顆粒越大的，F(xiàn)SC就越大；內(nèi)部結(jié)構(gòu)越復(fù)雜的，SSC就越大。怎么理解呢？比如對(duì)于FSC，磁珠的顆粒越大，磁珠的投影也就越大，對(duì)應(yīng)的光圈也就越大。比如你用激光去照射一粒面粉和一粒大米，大米的外部光圈肯定會(huì)更大。對(duì)于SSC，我們可以想象一下，你用激光照射一堆透明的玻璃球，和照射一堆內(nèi)部鑲嵌了小星星的玻璃球，肯定后者的側(cè)面散射光信號(hào)更強(qiáng)。
那好了，流式儀器一般會(huì)用激光照射并收集FSC和SSC，做二維坐標(biāo)圖，根據(jù)圖像來(lái)分別不同的磁珠。但是有一個(gè)問(wèn)題，如果磁珠的制備工藝相似，那么它們的內(nèi)部結(jié)構(gòu)就類似，導(dǎo)致SSC都普遍接近，最終起到區(qū)分作用的只有FSC這個(gè)指標(biāo)。但是我們希望不同項(xiàng)目的磁珠粒徑盡量接近（4-6um），反應(yīng)才比較均衡，所以僅僅靠FSC和SSC來(lái)區(qū)分的磁珠，可用性很小。
2.摻入熒光素。
有的公司只摻入了一種熒光素，比如蘇州為度新開發(fā)的流式磁珠，首先靠FSC區(qū)分4um和5um的兩個(gè)群體，然后每個(gè)群體又摻入了9個(gè)梯度的熒光素APC，最終做出了18重磁珠，這是一種開發(fā)思路；但是我們上面講到了，磁珠的粒徑最好是一致的，所以像是深圳唯公的磁珠，就摻入了兩種熒光素，也就是磁珠的粒徑都一樣，靠的是兩種熒光素的摻入比例來(lái)進(jìn)行區(qū)分，這與luminex的開發(fā)思路是一致的，這樣做出來(lái)的磁珠種類更多，也更利于免疫檢測(cè)。
然后再講一下反應(yīng)模式。
對(duì)于自身免疫和過(guò)敏原這種抗體檢測(cè)項(xiàng)目，一般都是采用的間接法。也就是磁珠標(biāo)記抗原，檢測(cè)抗體為PE（藻紅蛋白）標(biāo)記的抗人IgM或抗人IgG或抗人IgE等。
也許有人會(huì)問(wèn)，能不能采用捕獲法呢？標(biāo)記抗人Ig抗體，然后用不同的蛋白標(biāo)記PE來(lái)進(jìn)行檢測(cè)？這樣是不行的。雖然磁珠仍然可以分開，但是它們都可以抓住不同類型的Ig抗體，可以出現(xiàn)一陽(yáng)全陽(yáng)的局面，這顯然是不可行的。
對(duì)于雙抗夾心的項(xiàng)目，同樣是將標(biāo)記抗體分別標(biāo)記不同的磁珠，對(duì)于檢測(cè)抗體，一般有兩種操作：
一是將各個(gè)抗體分別標(biāo)記PE，然后進(jìn)行混合；
二是將各個(gè)抗體分別標(biāo)記Biotin，最終借助SA-PE進(jìn)行最終的檢測(cè)。
一的難點(diǎn)是抗體與PE的標(biāo)記，這對(duì)于很多公司都是一個(gè)技術(shù)壁壘，感覺操作容易產(chǎn)生很大的批間差。
二的特點(diǎn)是生物素標(biāo)記比較簡(jiǎn)單，但是因?yàn)榻柚薙A-PE，所以反應(yīng)步驟會(huì)增加，反應(yīng)時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，對(duì)于反應(yīng)時(shí)間有要求的項(xiàng)目，則需要斟酌一下。
流式熒光與化學(xué)發(fā)光在研發(fā)上的區(qū)別？
不管是流式磁珠還是發(fā)光用的磁珠，目前大部分都還是羧基磁珠，所以在標(biāo)記工藝方面來(lái)說(shuō)幾乎是一樣的，只不過(guò)在數(shù)量方面會(huì)有較大差別。流式磁珠在使用的時(shí)候一般按照個(gè)數(shù)計(jì)量（如1×10^5個(gè)/mL），發(fā)光磁珠則一般按照重量單位mg/mL進(jìn)行計(jì)量，所以發(fā)光的磁珠和抗體消耗是相對(duì)較大的。但是我們得相信，量的積累一定會(huì)保證質(zhì)的提升，所以發(fā)光試劑在準(zhǔn)確度方面一般是優(yōu)于流式熒光的。
并且由于流式磁珠是逐個(gè)地去測(cè)試熒光值，每個(gè)磁珠的熒光值難免存在差異，熒光結(jié)果的報(bào)告也會(huì)有不同的形式，可以用平均值，也可以采用中位數(shù)，但是這個(gè)數(shù)據(jù)也是會(huì)隨著圈圈的大小和位置不斷地變化。
況且，由于微球反應(yīng)完成后會(huì)出現(xiàn)聚集的情況，反應(yīng)前和反應(yīng)后的位置會(huì)發(fā)生位移，甚至有的出現(xiàn)明顯地分散，導(dǎo)致距離太近的微球難以區(qū)分彼此，導(dǎo)致結(jié)果的誤判。比如下圖的例子，對(duì)于黃色標(biāo)注的區(qū)域，我們很難界定微球的隸屬關(guān)系，如果其中一個(gè)項(xiàng)目是陰性，一個(gè)項(xiàng)目是陽(yáng)性，圈的位置稍有差池，兩個(gè)項(xiàng)目的可能就都報(bào)成了陽(yáng)性。
2023-9-8 |
