在實際工作中，在金溶膠中加入蛋白質(zhì)后，會由于靜電、疏水和范德華力相互作用而引發(fā)其在金顆粒表面的自發(fā)吸附，這是膠體金標(biāo)記得以進行的基礎(chǔ)。離開這個基礎(chǔ)，膠體金標(biāo)記是沒辦法進行的。
為了制備金顆粒標(biāo)記的蛋白質(zhì)，通常先將將金懸浮液攪拌混勻（你肯定遇到過這種情況：如果顆粒比較大，放置一段時間會出現(xiàn)顆粒下沉，注意此處不是金顆粒形態(tài)發(fā)生變化導(dǎo)致的聚沉！而只是因為重力作用引起的正常金顆粒在溶液中的非均勻分布。因此標(biāo)記時候需要混勻后使用），同時加入大量的蛋白質(zhì)。當(dāng)金顆粒與蛋白質(zhì)分子結(jié)合時，隨著金顆粒變得穩(wěn)定和裸金顆粒的減少，特征波長處的吸光度通常會下降。為了檢查吸附過程的完整性，并確定金顆粒是否完全被飽和標(biāo)記，我們可以取一部分液體，并加入少量氯化鈉溶液。如果在加入氯化鈉后發(fā)生聚沉，則說明金顆粒還有沒被蛋白吸附存在比較多的裸金顆粒，應(yīng)該添加更多的蛋白質(zhì)來進一步吸附裸金顆粒。最后，通常會添加聚乙二醇（PEG）或免疫反應(yīng)阻斷劑，如BSA或脫脂奶粉溶液，來進一步穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)合后的膠體懸液。這些封閉蛋白基本會完全占據(jù)絕大分部分潛在的金-金復(fù)合物或金-蛋白復(fù)合物相互作用的剩余位點，從而防止了在存儲、檢測過程中的聚集或非特異性結(jié)合。
關(guān)于待標(biāo)記蛋白用量，大部分研發(fā)人員通常的做法是：先確定防止Nacl造成的聚集的最少蛋白質(zhì)所需量，在此基礎(chǔ)上增加約10-20%的過量蛋白（霍里斯伯格和羅塞特，1977；De Mey等人，1981）。但這個確定蛋白具體用量多少的工作其實針對大部分項目或者新手研發(fā)人員來說，已經(jīng)沒有太多必要去動手再確定到底多少蛋白才是最少量，除非是項目蛋白成本很高，你可以去做個試驗往下走走好好降降成本。膠體金技術(shù)這么多年下來，N多的被后浪拍在沙灘上且已經(jīng)被曬得嘎嘣脆的研發(fā)前輩早已經(jīng)留下了適合絕大部分項目標(biāo)記的蛋白使用量。通常來說10ug/ml的用量已經(jīng)絕對能讓你的蛋白豐度夠到姥姥家了，筆者甚至試過3ug/ml的用量姥姥家都表示夠用了。但是需要注意的是，如果你使用的金溶液濃度比較高的話，還是需要相應(yīng)按照適當(dāng)?shù)谋壤岣叩鞍椎氖褂昧?，否則姥姥就有可能告訴你蛋白用量有點點不那么給力了。
總體來說，為了獲得比較理想的標(biāo)記物之外，在用金顆粒標(biāo)記蛋白質(zhì)時，需要考慮幾個參數(shù)：
(1)蛋白質(zhì)的pI，
(2)吸附過程的pH，
(3)標(biāo)記反應(yīng)中的蛋白質(zhì)的量。
一般認(rèn)為，大多數(shù)蛋白質(zhì)可以在其等電點或附近最大限度地和膠體金顆粒進行吸附（Norde，1986）。但是就pH這個參數(shù)，在金標(biāo)記過程中再怎么強調(diào)也不為過，甚至可以說“成也pH，敗也pH”.這個參數(shù)對憑金標(biāo)記這個技能混江湖的人來說絕對算得上是內(nèi)家真氣般的存在。沒有一定程度的修煉是不好去江湖隨便飄的。甚至有些待標(biāo)記蛋白的純度、性能決定了標(biāo)記過程pH會出現(xiàn)和常規(guī)做法特別不一樣的要求，先舉例說明如下：
A、對于許多蛋白質(zhì)，特別是抗血清來源的免疫球蛋白，平均pI是一個包含一系列pH值的范圍。因此，多克隆抗體制備可能具有與特定純化的單克隆抗體非常不同的平均pI。這一點相信廣大金標(biāo)研發(fā)人員是有所體會的，通常就是多抗比較好標(biāo)記，但是活性不盡如人意，單抗雖然沒多抗好標(biāo)，但標(biāo)記出來后效果喜人。原因就在于此。
B、另外一點，個別蛋白對pH非常挑剔，當(dāng)你用第一步調(diào)整好pH的金溶液中加入蛋白后，一切反應(yīng)都很和諧、美好，反應(yīng)的頁面也很絲滑，但當(dāng)你第二次加入封閉蛋白后滿懷希望的等待收貨美好的標(biāo)記物時，詭異、慘烈的畫面通常會出來把你英俊瀟灑的臉摁花崗巖地面上摩擦一頓：你會發(fā)現(xiàn)溶液會慢慢的、逐漸的變成藍(lán)色、或者紫色，甚至?xí)谐恋砦龀?，人品差的他最后直接會給你變成一汪清水！咦，他怎么就變色兒呢？他怎么能變色了呢！問題是，你這一變色兒，你讓你旁邊新招來的實驗助手小妹妹對你那崇拜的眼神往何處安放？！是啊，他怎么就變色兒了呢？其實，這個問題主要是就是待帶標(biāo)記蛋白對pH非常敏感造成的，加入封閉蛋白后改變了溶液pH所致，需要你在加入封閉蛋白過程中持續(xù)穩(wěn)定溶液的pH才能讓標(biāo)記過程進行下去。
就算你確定好了標(biāo)記pH，咱們通常會加入碳酸鉀到金溶液里邊去，然后再攪拌。但是，我告訴你，你如果對你的pH計下手夠狠的話，你可以用探頭直接伸入到你的金溶液里邊，然后睜大眼睛瞅個faiwu分鐘，我保證你會看見一個魔幻的情況出現(xiàn)：你調(diào)整好的金溶液的pH它就像遙遠(yuǎn)星空的星光一樣一閃一閃的在你眼前欻欻跳動并且一直往下降。通常faiwu分鐘估計至少能給你掉個0.5個pH！厲害吧，刺激吧？是不是又聽到了你那英俊的臉和花崗巖摩擦的呲呲聲！開始我遇到這種情況就傻眼了，心想：這啥情況哇！那啥、實驗前我特意用清水洗手了三遍吶！看見小偷偷東西我也喊了呀！公交車上我也給老奶奶讓座了哇，過斑馬線我也沒闖紅燈撒。臥槽，肯定是過馬路的時候走在我身邊的老奶奶我沒扶她！其實不是我不想扶她，是她走路速度比我快！等你在心里對心靈徹底來一次滌蕩后，我們來處理這個問題，原則就是：多次平衡，盡快結(jié)合。多次平衡控制pH的下降幅度，盡快結(jié)合縮短波動時間。
雖然我們說蛋白質(zhì)與金顆粒的標(biāo)記沒有普遍一致的標(biāo)準(zhǔn)，但可以通過遵循下面這些一般準(zhǔn)則來提高標(biāo)記過程的效率：
(1)在pH的pI范圍內(nèi)或略高于pI；但在實際中往往這個策略效果一般，真的勇者往往出其不意而獲得意外之喜。期待你也一樣！大膽往往能讓你成為整個實驗室最靚的仔！
(2)向金顆粒注入的蛋白質(zhì)量比氯化鈉破壞實驗時略高（約10%）；
(3)避免蛋白質(zhì)的高飽和，因為這可能會促進結(jié)合材料的浸出；這點真的可以采納，10ug/ml用量絕對姥姥家夠了，甚至舅舅家也都夠了。省時間可以直接用這個量，省出寶貴時間給實驗助手培訓(xùn)下理論和實驗注意事項的細(xì)節(jié)它不香嗎？
(4)通過測定溶液在特征波長處的吸光度來評價金顆粒的吸附程度和聚沉程度；
(5)優(yōu)化每個蛋白質(zhì)-金顆粒偶聯(lián)物，來確定膠體的穩(wěn)定性和活性。優(yōu)化工作是個細(xì)活，需要花時間和精力去做、熬，這是也絕大部分小白菜成長為大神的最好的路、其實也是最好的捷徑。這個工作相當(dāng)于在對標(biāo)記工作做PDCA持續(xù)改進，同時、他對你獲取、維持實驗室標(biāo)記崗位的王霸之位有舉足輕重的作用，實踐出真知，真知出權(quán)威。
如此，只要是在每次標(biāo)記的過程中出現(xiàn)詭異事件，江湖的朋友會不約而同的翹首以盼且眾望所歸于你身上，希望你重出江湖，一劍定乾坤！當(dāng)然也少不了收獲你助手小妹妹那崇拜的眼光！
2023-8-21 |
